تبلیغات
Create your flash banner online in 5 step سایت تخصصی رشته میکروبیولوژی - تشخیص تب مالت
این سایت نمایندگی رسمی فروش لاینسس و دانلود انتی ویروس NETQINاست بر روی بنر کلیک کنید
تشخیص تب مالت

تب مالت بیماری عفونی است و عوامل ایجاد كننده آن در انسان كوكوباسیل گرم منفی میباشد كه شامل:


 1- بروسلا B-Melitensis كه بیشتر در بز ،گاو و گوسفند و مسئول اكثر موارد تب مالت در ایران می باشد.
2- بروسلا B-Abortus در گاو
3- بروسلاB-Suis در خوك
4- بروسلا B-Canis در سگ ایجاد بیماری می كند.
آنتی ژنهای بروسلا: آنتی ژنهای AوM به لیپو پلی ساكارید دیواره سلول باكتری مربوط میباشد ضمنا" بروسلا آنتی ژن مشترك با ویبره كلره داشته و واكسیناسیون بر علیه وبا تیتر آنتی بادی بروسلا را بصورت كاذب با بعضی از آنتی ژنهای ساخته شده بالا می برد.
آنتی بادی:
در پاسخ ایمنی هومورال بروسلوز ) IgG,IgM 1IgGوIgG2 IgA,( مقدار جزئی IgE تولید گردیده كه بویژهIgG , IgM در آزمایشگاههای سرولوژی دخالت دارند ودر عفونت بروسلوز, IgM از روز پنجم تا هفتم ظاهر شده و در طی 13 تا 21 روز پس از ورود باكتری در بدن به میزان نهایی خواهد رسید. IgA نیز به مقدار كم در فاصله بین ظهور دو ایمونوگلوبولین فوق الذكر بوجود می آید.
در حالت بیماری تیتر IgG به مقدار بالا تر رسیده و دوام بیشتری دارد و در بررسی سرولوژی بروسلوز هنگامی كه سرم مورد آزمایش قرار می گیرد از ارزش زیادی برخوردار است . بدون تردید چنانچه سرم هفته اول آلودگی مورد بررسی باشد هیچگونه ایمونو گلوبولینی موجود نبوده و در نتیجه آزمایش منفی خواهد بود. در هفته دوم نقش برتر را IgM خواهد داشت. بین هفته دوم وسوم تشكیل IgG شروع شده و سه هفته پس از آن به اوج خواهد رسید و در حالت عفونت كماكان نقش غالب را خواهد داشت .برای تشخیص سرولوژی بروسلوز انسان ازمایشهای رزبنگال , سرو آگلوتیناسیون رایت , 2- مر كاپتواتانول , ثبوت عناصر مكمل وآنتی گلوبولین كومبس به روش استاندارد ویا استفاده از روشهای استاندارد شده توسط تولید كننده های داخلی انجام می پذیرد. اكثر بیماران مبتلا به بروسلوز حاد در تمامی آزمایشها واكنش مثبت نشان میدهد معمولا" آزمایشهای رزبنگال و رایت به جهت آنكه هر دو ایمونوگلوبین GوM در آنها دخالت دارند زودتر از دیگر آزمایشها واكنش دارد.
در آزمایشهای 2- مركاپتواتانول وثبوت عناصر مكمل, IgG مداخله نموده كه از نقطه نظر تفكیك وضعیت ایمنی یا عفونت مفید می باشد.
در مواردی كه آنتی بادی هایی وجود داشته باشند و آگلوتیناسیون واضح ایجاد نمی نماید آزمایش
كومبس ازارزش خاصی برخوردار است.
در بررسی سرولوژی بیماری تعیین تفاوت تیتر دو نمونه سرم در حداقل به فاصله دو هفته با ارزش می باشد ضمنا" در افرادی كه تماس مكرر با آنتی ژن بروسلا دارند آزمایشهای سرمی مثبت بدون علائم بالینی مشاهده می شود از اینرو نتایج آزمایشهای سرمی در بروسلوز شغلی از اهمیت محدودی برخوردار است.
گاهی اوقات نیز نتایج مثبت کاذب ناشی از واکنش متقاطع سایر آنتی بادیهای باکتریها با آنتی ژن بروسلا مشاهده می گردد. بنا براین به منظور تشخیص بروسلوز بکارگیری روشهای استاندارد آزمایشگاهی توام با اطلاعات کسب شده اپید میولوژی - کلینیکی- آزمایشگاهی مورد نظر میباشد.
روشهای سرولوژی استاندارد:
1-روش آگلوتیناسیون سریع با آنتی ژن ویژه این روش
(لوازم مورد لزوم):
1-پلیت شیشه ای مخصوص آزمایش سرولوژی
2-آنتی ژن قابل مصرف و فاقد اتو آگلوتیناسیون
3-كنترل مثبت و كنترل منفی
4-روتاتور واپلیكاتور جهت مخلوط نمودن سرم و آنتی ژن
آنتی ژن رزبنگال به رنگ قرمز و باPH اسیدی برابر 65/3 و به میزان 8% جرم میكربی بروسلا آبورتوس در دسترس می باشد و بیشتر این روش جهت تشخیص اولیه در برنامه های كنترل و ریشه كنی بروسلوز به عنوان تست غربالی بكار برده می شود و توصیه می شود بعلت احتمال بروز پدیده پروزون و مشاهده پاسخ منفی كاذب ، آزمایش تمامی نمونه های سرم با روش لوله ای انجام شود . در صورت انجام ازمایش به روش سریع و بر روی پلیت ، از یك قطره سرم ( حدود 25-30 میكرو لیتر )و یك قطره آنتی ژن (حدود25-30میكرولیتر) استفاده می شود و موارد مثبت به روش لوله تعیین مقدار شود و از تیتراسیون تست با پلیت خودداری گردد و سعی شود كه در این آزمایش از كنترل مثبت و منفی استفاده شود و آگلوتیناسیون با نمونه كنترلی منفی و مثبت مقایسه گردد.
2-آزمون آگلوتیناسیون رایت در لوله:
(لوازم و مواد مورد نیاز):
1-لوله همولیز
2-آنتی ژن مخصوص لوله ای ساخت داخل كه فاقد اتو آگلوتیناسیون باشد و قابل مصرف طبق تاریخ ساخت می بایستی تا هنگام مصرف دور از نور و در یخچال 4 درجه سانتی گراد نگهداری شود.
3- نمك طعام و فنل
4-پارافیل جهت بستن درب لوله ها
5-سرم كنترل مثبت و منفی جهت تهیه شاهد
طرز تهیه سرم فیز یولوژی فنیكه :
5/8گرم كلرور سدیم و 5 گرم فنل را در 1000 میلی لیتر آب مقطر حل نمایید. توصیه می شود برای از بین بردن پدیده پروزن بجای 5/8 گرم 50 گرم نمك طعام و5 گرم فنل را در یك لیتر آب حل نمایید.
روش آزمایش :
در یك ردیف لوله همولیز از سرم مورد آزمایش رقت های 1:5 , لغایت 1:640یا 1:1280 به ترتیب ذیل تهیه نمایید :
A: در لوله اول8/ . میلی لیتر و در لوله های بعدی 5/ . میلی لیتر سرم فیزیولوژی فنیكه بریزید .
B: 2/ . میلی لیتر از سرم مورد آزمایش به لوله اول اضافه كرده (رقت 1:5 ) از لوله اول نیم میلی لیتر به لوله دوم اضافه كنید (رقت 1:10 ) مخلوط نموده به همین ترتیب تا لوله آخر ادامه داده و از لوله آخر 5/ . میلی لیتر اضافه را بعد از مخلوط كردن دور بریزید .
C: آنتی ژن را به مقدار مورد نیاز تهیه (در صورت نیاز به رقیق شدن بر حسب دستور العمل رقیق گردد) و به هر لوله 5/ . میلی لیتر اضافه نمایید در نتیجه رقت های نهایی با احتساب حجم آنتی ژن 1:10 , 1:20 , 1:80 و ... الی آخر بدست آید .
D: تهیه شاهد منفی و مثبت:
(1)برای تهیه شاهد منفی 5/ . میلی لیتر آنتی ژن رقیق شده یا آماده مصرف را در یك لوله همولیز ریخته و نیم میلی لیتر محلول سرم فیزیولوژی فنیكه به آن می افزاییم .
(2)برای تهیه شاهد مثبت یك نمونه سرم مثبت قوی را به صورت 1:5 رقیق نمایید .
(100 میكرولیتر سرم + 400 میكرولیتر سرم فیزیولوژی فنیكه) سپس 5/ . میلی لیتر از آن را با 5/ . میلی لیتر آنتی ژن آماده مصرف در یك لوله ریخته و مخلوط نمایید .
E: محتوی لوله ها را كاملا" مخلوط و درب لوله ها را با پارافیلم بسته و به مدت 20 تا 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتی گراد قرار داده و به ترتیب نتیجه را قرائت می كنیم .
قرائت نتایج :
بر مبنای میزان شفافیت مایع فوقانی (با مقایسه لوله شاهد ) و آگلوتیناسیون ایجاد شده نتایج بر حسب تیتر لوله ها (رقت لوله ها ) گزارش می گردد و با بیشترین رقت لوله ای كه نسبت به لوله شاهد منفی ، 50 درصد شفافیت یا آگلو تیناسیون را نشان می دهد تیتر نهایی آزمایش بدست می دهد . ضمنا" در مورد تفسیر آزمایش رایت وتعیین تیتر آلودگی هنوز اتفاق نظر وجود ندارد . در كتب و مقالات پزشكی غربی به علت اینكه بیماری شیوع چندانی ندارد و تعداد مبتلایان اندك می باشد و فقط بیماری یك بیماری شغلی محسوب شده و به وسیله بروسلا آبورتوس و سوئیس با تماس مكرر بوجود می آید و آلودگی با بروسلا ملی تنسیس رواج ندارد، تیتر قابل ارزش برای درمان 1:160 میباشد، ولی در ایران بیشتر آلودگی با بروسلا ملیتنسیس گزارش شده و شیوع بیشتری دارد و تیتر 1:80 به بالا برای درمان ارزش بیشتری دارد لیكن تیتر های پایین تر و بویژه در ارتباط با بیماریهای غیر شغلی نبایستی كم اهمیت در نظر گرفته شود، مگر در صورتیكه از نظر كلینیكی تظاهرات وجود نداشته ، تیتر آزمایش دو هفته بعد رو به افزایش نبوده ، كشت خون منفی بوده ، یا در آزمایش IgG , 2ME فعال وجود نداشته باشد .
آزمایش 2- مركاپتواتانول: 2-Mercaptoethanol(2ME)Brucella Agglutination Test
[تستهای معمول آگلوتیناسیون برای تشخیص بروسلوز تنها وجودیا عدم آگلوتینین های ضد آنتی ژن بروسلا را در سرم بیمار مشخص می نماید. بدون آن كه قادر به افتراق نوع آگلو تینین های موجود یعنیIgM از IgG باشند . آزمایش 2ME برای تعیین ماهیت ایمونوگلوبولین موجود در سرمی كه سبب اگلوتیناسیون می شود انجام میگیرد . 2- مركاپتواتانول ماده احیاء كننده ایست كه درغلظت معین باندهای دی سولفید (disulphide bond ) IgM را شكسته وباعث از بین رفتن خاصیت آگلو تیناسیون IgM می شود . اگر سرم بیمار قدرت آگلوتیناسیون خود را پس از مجاورت با 2ME از دست بدهد نشاندهنده اینست كه آگلوتینین موجود IgM بوده است ولی اگر قدرت آگلوتیناسیون سرم پس از تاثیر 2ME باقی بماند دلیل بر وجود آگلوتینین IgG و تیتر بدست آمده همان تیتر IgG میباشد . آزمایش 2ME به همان روش آگلوتیناسیون لوله ای رایت (Wright) انجام می گیرد با این تفاوت كه رقتهای سرم ، در سرم فیزیولوژی حاوی 2ME تهیه می گردد. می توان بجای 2ME از ماده دیگری بنام Dithiothrietol( محلولی با غلظت 005/0 مولكول گرم ) استفاده كرد .
ضمنا به سبب قابلیت اكسید شدن بیش از حد 2MEدر رقتهای بالا اعتقاد بر این است كه باید از بافر تازه تهیه شده 2MEبرای تعیین طبیعت آنتی بادی موجود در سرم بیمار استفاده گرددو پیشنهاد می نماید كه برای این هدف بهتر است ماده احیاء كننده را تازه و روزانه و با سرم مورد آزمایش مخلوط نموده و سپس آزمون آگلوتیناسیون را ا نجام داد .
روش انجام آزمایش :
مواد مورد لزوم :
1-محلول غلیظ2- مركاپتو اتانول
2-لوله همولیز
3-آنتی ژن لوله ای انستیتو پاستوریا انستیتو رازی كه اتو آگلو تیناسیون نداشته و یكنواخت و هموژن باشد .
-A ابتدا محلول 2/0 ملكول گرم در لیتر 2ME در آب مقطر تهیه می كنیم (68/0 میلی لیتر مركاپتو اتانول در 0 5 میلی لیتر آب مقطر)
سپس به تعداد نمونه های سرم مورد آزمایش لوله همولیز در نظر گرفته ودر هر لوله 3/0 ملی لیتر سرم فیزیولوژی + 2/0 میلی لیتر سرم بیمار + 5/0 میلی لیتر محلول مركاپتو اتانول می ریزیم .
-B لوله را بمدت یكساعت در اتو 37 درجه قرار میدهیم تا مركاپتو اتانول بر روی IgM اثر نماید.
-C لوله هارا از اتو خارج ساخته و برای هر نمونه سرم به مانند سرو آگلوتیناسیون در لوله تعداد مورد نیاز لوله همولیز در نظر می گیریم و رقتهای سریال (serial dilution) تهیه می كنیم بدین ترتیب كه به استثنا لوله اول ( كه لوله حاوی سرم و مركاپتواتانول می باشد ) در تمام لوله ها 5/0 میلی لیتر سرم فیزیولوژی می ریزیم سپس از محتوی لوله اول 5/0 میلی لیتر به لوله دوم می ریزیم و پس از مخلوط كردن از لوله دوم 5/0 میلی لیتر به لوله سوم انتقال می دهیم. این عمل را تا لوله ما قبل آخر ادامه می دهیم و از این لوله5/0 میلی لیتر دور ریخته می شود. ( لوله آخر به عنوان كنترل است كه فقط حاوی سرم فیزیولوژی وآنتی ژن خواهد بود )رقت های نهایی از 1:10تا 1:5120 خواهد بود .
-D به هر لوله مقدار 5/0 میلی لیتر از همان آنتی ژن سرو آگلو تیناسیون لوله ای می ریزیم (یا آنتی ژن مخصوص 2ME ساخت انستیتو پاستور)
-E لوله هارا به مدت 24-20 ساعت در اتو 37 درجه قرار می دهیم و سپس لوله هارا از نظر وجود آگلو تیناسیون بررسی می كنیم.
پس از تاثیر 2ME بر روی سرم آگلوتینین های با ماهیت IgM حذف می شوند و چون آگلوتیناسیون مورد مشاهده تنها ناشی از وجود IgG است لذا تیتر IgG موجود در سرم را نشان می دهد . ضمنا توصیه می شود كه محلول رقیق شده 2ME در روز مصرف تهیه شود و تامپون مصرفی بدون فنل مورد استفاده قرار گیرد .
بطور معمول تیتر قبل از درمان 1:40 به بالا در آزمایش2- مركاپتو اتانول مثبت تلقی شده ضمن آنكه هر تیتری در این آزمایش و بویژه تیتر 1:20 می تواند نشانه ای از آلودگی بوده مگر این كه خلاف آن ثابت شود .
آزمایش آنتی هیو من گلو بو لین (( كومبس رایت )):
روش آزمایش : به منظور انجام این آزمایش به ترتیب زیر عمل می شود :
1-رقتهای سرم مورد آزمایش مشابه روش سرو گلوتیناسیون در لوله با سرم فیولوژی یا بافر فسفات با 2/7 = PH به حجم 5/0 میلی لیتر تهیه شود .
2-آنتی ژن رایت به نسبت توصیه سازنده با سرم فیزیولوژی رقیق شود و سپس به حجم 5/0 میلی لیتر به هر لوله اضافه گردد.
3-لوله ها را به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتیگراد قرار داده و پس از این مدت نتیجه را قرائت نمایید .
4-پس از ثبت نتایج ، تمام لوله ها ئیكه دارای آگلو تیناسیون كامل یا جزیی باشند كنار گذاشته شود.
5-بقیه لوله ها را به مدت 10 دقیقه با دور 2000 در دقیقه سانتریفوژ نموده و مایع رویی را با دقت جدا نموده و دور بریزید و رسوب را با یك میلی لیتر بافر فسفات یا سرم فیزیولوژی مخلوط و مجددا سانتریفوژ كنید .
6-مرحله سانتریفوژ را 3 مرتبه تكرار نمایید .
7-رسوب نهایی را با 9/0 میلی لیتر بافر فسفات یا سرم فیزیولوژی و 1/0 میلی لیتر آنتی هیومن گلوبولین مخلوط و به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه قرار دهید .
8-پس از انقضای زمان مذكور نتایج واكنش را قرائت كنید .
در بروسلوز مزمن و طولانی ممكن است IgM دیگر تولید نشوند و آنتی بادی IgG و كلاس های IgG1 و IgG2 كه بیش از 80% IgG موجود را تشكیل می دهد نیز سنتز نگردد. و تنها آنتی بادی ضد بروسلایی موجود شامل IgG3و IgG4 باشد كه از نظر كمی و كیفی خیلی ضعیفتر از IgG1 و IgG2 و IgM ضد بروسلایی واكنش می دهند . توضیح اینكه این آنتی بادی ها در تست رایت نتیجه منفی كاذب بوجود می آورند ولی در صورت افزودن آنتی هیومن گلوبولین و انجام تست كومبس رایت نتیجه مثبت حاصل خواهد شد و در تست كومبس رایت تیتر قابل ارزش 40/1 به بالا می باشد و اگر علامتی از نظر بیماری نیز مشاهده شود نتیجه را با ارزش تر می نماید.

(( طرز تهیه بافر فسفات با 2/7=PH و غلظت ده برابر بدین ترتیب است ))
1- فسفات مونو سدیك با دو ملكول آب =g 03/2
2- فسفات دی سدیك بدون آب = g 36/12
3- نمك طعام = g 80
را در یك ظرف یك لیتری ریخته و حجم می رسانیم و در موقع مصرف 1:10 رقیق می كنیم .
لازم به توضیح است برای تشخیص آزمایشگاهی بروسلوز آزمایشهای مختلفی با حساسیتهای گوناگون به نامهای آزمون ثبوت مكمل ، آزمون هماگلوتیناسیون غیر مستقیم، آزمونهای ایمونواسی و روش الكتروفورز counter-current ((CIEP نیز انجام می گیرد.
azkade.com