تبلیغات
Create your flash banner online in 5 step سایت تخصصی رشته میکروبیولوژی - نحوه ی تهیه محیط کشت میکروبی (Blood agar)
این سایت نمایندگی رسمی فروش لاینسس و دانلود انتی ویروس NETQINاست بر روی بنر کلیک کنید
نحوه ی تهیه محیط کشت میکروبی (Blood agar)

مقدمه:
برای مطالعه میكروارگانیسم ها باید بطریقی آنها را بر روی محیطهای مناسب از نظر شرایط فیزیكی و شیمیایی كشت داد . مطالعه زیاد درباره میكروارگانیسم ها و نحوه زندگی آنها باعث شده كه تا كنون انواع زیادی از محیط كشت با تركیبات متفاوت به طور مصنوعی برای استفاده در آزمایشگاههای میكروبیولوژی تهیه شود . هرچند انواع این محیط كشت ها زیاد می باشند، معهذا در مواردی برای كشت نوع بخصوصی از یك میكروارگانیسم باید از یك نوع محیط كشت بخصوص با تركیبات مشخص استفاده شود.

بطور كلی محیط های كشت باید دارای مشخصات معینی باشند و هنگام تهیه و استفاده از محیط كشتها باید به نكات زیر توجه شود :

تمام محیط كشتها باید واجد مواد غذایی ضروری برای رشد میكروبها باشند
PH محیط كشت باید در حد معین قبل از استفاده برای كشت تنظیم شود.
ظروف مورد استفاده برای تهیه محیط كشتها باید كاملا تمیز و عاری از مواد خارجی باشند .
آب مقطر مورد استفاده باید بطریقه صحیح تهیه شود .
درجه حرارتی كه برای استریل كردن محیط كشت مصرف می شود باید نسبت به نوع مواد غذایی مربوط در محیط كشت در نظر گرفته شود . درجات بالا باعث از بین رفتن برخی از مواد شیمیایی موجود در محیط كشت می شوند .


محیط های كشت باكتریها به سه صورت زیر تهیه میشود :

محیط كشت مایع یا آبگوشتی (liquid or broth media)
محیط كشت جامد (solid media)
محیط كشت نیمه جامد (semi solid media)

محیط كشت مایع ( براث ) :

این محیط فاقد آگار و فقط در لوله آزمایش یا فلاسك استفاده میشود . مثل محیط نوترینت براث.

محیط كشت جامد :

این محیط حاوی 5/1 تا 2 درصد ماده آگار است كه بعد از سرد شدن منعقد می شود . محیط كشت جامد را درون لوله آزمایش یا پلیت استفاده می كنند.مثل محیط TSI و M.c



دلیل بكارگیری محیط جامد ، تشخیص باكتریها به وسیله :

تشكیل كلنی
تولید پیگمانت
خصوصیات خاص هر كلنی
تشخیص انواع باكتریها كه چند نوع باكتری در نمونه میكروبی وجود دارد .
موكوئیدی بودن باكتری
دیدن منطقه همولیز .
محیط كشت نیمه جامد :

این محیط در تركیب خود مقدار كمی آگار دارد . بنابراین كاملا منعقد نمی شود و نیمه جامد باقی می ماند . مثل محیط SIM .

آگار :

ماده ای پلی ساكاریدی است كه از یك نوع جلبك قرمز دریایی تهیه می شود، در 95c ذوب و در حرارت 42c منعقد می گردد .

محیط های كشت باكتری را از نظر نوع مواد تشكیل دهنده و از نظر كاربرد به چهار دسته تقسیم می كنند:


محیط كشت پایه (Basic Media) :
این محیط كمترین مقدار مواد غذایی برای رشد باكتریها را دارد . و مبنای تهیه انواع و اقسام محیطهای كشت می باشد . اكثر انواع باكتریها در آن رشد می كنند زیرا فاقد ماده ضد میكرب است . مانند محیط نوترینت آگار ، نوترینت براث .

محیط كشت غنی كننده (Enrichment Media) :
محیط مقوی بوده كه دارای مواد تغذیه ای زیادی نظیر ویتامین ها ، لیپید ها ، اسید های آمینه برای رشد باكتری است . بنابراین تعداد زیادی از باكتریها روی آن بخوبی رشد می كنند . مانند شكلات آگار، بلادآگار .





محیط كشت افتراقی (Differential Media) :
محیط كشت تشخیصی بوده كه كلنی باكتریهای مختلف روی آن كاملا از همدیگر متمایز می گردد. مانند محیط E.M.B ، M.c این محیطها دارای املاح صفراوی ، قند و معرف شیمیایی هستند كه باكتریهای لاكتوز مثبت برروی آنها كلنی های صورتی رنگ و باكتریهای لاكتوز منفی نظیر سالمونلا ، شیگلا بر روی این محیط ها كلنی های سفید رنگ تشكیل می دهند . از محیطهای افتراقی دیگر محیط TSI ، سیمون سیترات را میتوان نام برد . این محیط ها برای رشد باكتریهای گرم – منفی روده ای (انتروباكتریاسه) مناسب هستند . چون وجود املاح صفراوی در محیط مانع از رشد باكتریهای گرم مثبت در محیط می شوند.



محیط كشت اختصاصی (Special Media) :
این محیطها برای رشد باكتریهای خاصی مناسبند . از این محیطها برای ایزوله نوع خاصی از باكتری در یك مخلوط میكربی استفاده می شود . مانند محیط s.s آگار كه برای جدا كردن سالمونلا و شیگلا بكار میرود یا مانیتول سالت آگار كه برای تشخیص گونه بیماریزای استافیلوكوكوس اورئوس استفاده می شود .



محیط كشت انتخابی : (Selective Media )
محیط هایی وجود دارند كه دارای یك ماده مهار كننده رشد می باشند این مواد رشد تمام ارگانیسم ها بجز ارگانیسم مورد نظر را مهارمی كنند . درمرحله اول از رنگ هایی كه دارای خواص ضد میكروبی هستند استفاده می شود ودر مرحله بعد استفاده از آنتی بیوتیك ها و مرحله آخر شامل وارد كردن مواد تركیبی به محیط كشت جهت فعالیتهای متابولیكی ارگانیسم مورد نظر می باشد . از آنجا ئیكه این محیط ها جهت ارگانیسم مورد نظر انتخاب شده اند و برای سایر ارگانیسم ها مضر می باشند آنها را محیط های انتخابی می نامند . مثالی از این نوع محیط ها ، محیط كشت فنیل اتیل الكل آگار است كه از رشد باسیل های گرم منفی هوازی و بی هوازی اختیاری ممانعت بعمل آورده و به ارگانیسم های گرم مثبت اجازه رشد می دهد .

طرز تهیه كلی محیط های كشت :


همانطوریكه می دانید محیطهای كشت به سه دسته جامد ، نیمه جامد ، مایع تقسیم می شوند . محیطهای مایع معمولاً فاقد آگار هستند یا مقدار آگارشان بسیار كم است . مثلاً حدود ( 2/0%) و محیط های نیمه جامد دارای مقدار كمی آگار حدود 3- 2 گرم وبالاخره محیط های جامد كه دارای 15- 13 گرم آگار در لیتر محیط هستند .

برای ساختن محیط های كشت باكتری، ما از پودر مخصوص كه در شیشه های مربوطه قرار دارد، استفاده می‌ كنیم. در روی این شیشه ها تركیب محیط بطور كامل و همچنین طرز ساختن آن نوشته شده است . مثلاً برای ساختن نوترینت آگار ابتدا مقدار لازم از پودر آن را وزن كرده ودر مقدار معینی آب مقطر كه قبلاً در یك ارلن مایر یا بطری ریخته اید اضافی نموده و آنرا كاملاً‌ حل نمائید وسپس با پنبه درب ارلن مایر را مسدود كرده و آن را روی سه پایه چراغ گازی حرارت می‌دهید ، تا زمان جوشیدن آنرا چند بار تكان دهید تا خوب حل شود و بمدت یك دقیقه بجوشد پس از آنكه مایع بجوش آمد ، آنرا برداشته وبا تكه كاغذ آلومینیومی روی پنبه را می‌پوشانید وظرف را در اتوكلاو می‌گذارید تا در فشار 15 پاند بر اینچ مربع و حرارت 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل شود . بعد از استریل كردن بگذارید تا خنك شود تا حدودc 45- 40 . سپس در حالیكه ارلن را در دست راست گرفته و پنبه آنرا با دست چپ كنار شعله خارج كرده‌اید ، دهانه ارلن را یكبار از درون شعله گاز عبور دهید وبعد درون پلیت های استریل شده بینcc 20- 15 از محل محلول بریزید . بعد پلیت ها را در كناری بگذارید تا سرد شوند وازتكان دادن آن خودداری نمائید وپس از جامد شدن محیطهای كشت نوترینت آگار را جمع كرده ودر دمای 37 بمدت 24 ساعت قرار دهید . اگر محیط ها آلوده نشده باشند آنها را از37c بیرون آورده و در یخچال 4 درجه سانتی گراد قرار می‌دهید .

طرز ساختن سایر محیطهای كشت، همینطور می‌باشد منتهی بعضی از محیطهای جامد در لوله مستقیم، پس از جوشاندن ریخته شده و بعد استریل می‌شوند كه این محیطها را پس از استریل شدن، به طور ایستاده می‌گذاریم مثل محیط SIM و یا كج می‌گذاریم مثل محیط TSI تا سرد شوند .

برای ساختن محیط مایع (براث) پس از جوشاندن، محیط را در لوله‌ ها تقسیم می‌كنیم و سپس با پنبه‌ای درب آنها را مسدود كرده و جهت استریل داخل اتوكلاو قرار می‌دهیم .

انواع محیط های كشت

محیط های كشت عمده ‌ای كه در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :



محیط نوترینت براث (Nutrient broth ):

این محیط مبنای ساخت اكثر محیطهای كشت است و از عصاره گوشت تهیه می‌شود طرز تهیه آن مثل نوترینت آگار می‌باشد . این محیط بدلیل نداشتن آگار بصورت مایع در لوله آزمایش تهیه می شود .



محیط نوترینت آگار (Nutrient agar):

چنانچه ماده آگار را به نسبت 5/1 تا 2 درصد با آبگوشت غذایی مخلوط كنیم، این آگار غذایی بدست می‌آید . این محیط مبنای تهیه انواع و اقسام محیط های كشت جامد مثل Blood Agar , Chocolate agar می باشد .



محیط آگار خوندار (Blood agar) :

اغلب نمونه های رسیده به آزمایشگاه میكروب شناسی بر روی محیط آگار خوندار كشت داده می‌شوند، چون این محیط از رشد تمام واغلب باكتریهای سخت رشد حمایت كرده و اغلب میكروب شناسان عادت دارند بر اساس مورفولوژی كلنی بر روی آگار خوندار تصمیم گیری نمایند . این محیط از یك محیط پایه مانند تریپتون كه منشاء پروتئینی دارد، كلرید سدیم آگار و 5 درصد خون تشكیل شده است . برخی باكتریها آنزیم های خارج سلولی تولیدكرده كه بر روی گلبول‌های قرمز عمل كرده و آنها راكاملاً لیز می‌كند (همولیزبتا ) یا یك تغییر سبز رنگ در اطراف كلنی ایجاد می‌كند ( همولیز ناقص یا آلفا ) در صورتی كه برخی از باكتریها تغییری ایجاد نمی‌كنند ( همولیزگاما) تولید همولیزین بوسیله باكتری به بسیاری از فاكتورهای محیطی مانند PH ، اكسیژن و دما بستگی دارد. میكروب شناسان اغلب از مورفولوژی كلنی و تولید همولیزین به عنوان آزمایشات غربالگری اولیه جهت كمك به تصمیم در انتخاب مراحل دیگر جهت شناسایی یك باكتری استفاده می‌كنند. جهت مطالعه درست واكنش همولیتیك بر روی آگار خوندار، كارشناس بایستی پلیت را در مقابل نور گرفته و مشاهده نماید. اگر از لوپ جهت كشت خطی بر روی آگار خوندار استفاده می‌شود باید آنرا در آگار فرو برده ( Stabbing) تا ارگانیسم بتواند در زیر سطح محیط كه اكسیژن كمتری دارد رشدكند . تولید همولیزین های حساس به اكسیژن در برخی از ارگانیسم ها بدین وسیله تشدید می‌گردد . به روش دیگر، می‌توان پلیت‌ها را جهت مشاهده واكنش همولیزین حساس به اكسیژن به طریق بی هوازی نیز انكوبه نمود.

طرز تهیه انواع محیط های كشت :

1- ابتدا مقداری آب مقطر در داخل یك ارلن ریخته پودر نوترینت آگار را به آن اضافه و حل نمائید .

2- محتویات ارلن را با آب مقطر به حجم برسانید .

3- محتویات ارلن را روی شعله حرارت دهید تا بجوشد و محیط شفاف شود .

4- محیط كشت را توسط اتوكلاو 15 دقیقه درحرارت c 1210 استریل كنید .

5- پس از استریل كردن، بگذارید تا حرارت محیط كشت به 0c50- 45 برسد آنگاه در شرایط استریل ودر مجاورت شعله ، با توجه به حجم محیط ساخته شده، 10ـ 5 درصد خون گوسفند به آن اضافه نموده و خوب بهم بزنید تا كاملاً مخلوط شود .

6- محیط را در مجاورت شعله داخل پتری دیش های استریل بریزید .

7- پس از پخش محیط در داخل پلیت ها چنانچه در سطح آنها حبابهای هوا تشكیل شود، بااستفاده از شعله حبابها را از بین ببرید .

8- ضخامت لایه آگار داخل پلیت ها نباید از 4-3 میلی متر تجاوز كند .

9- پس از آماده و منجمد شدن محیط های ساخته شده، پلیت ها را به مدت 24 ساعت در حرارت c370 انكوبه كنید . رشد باكتری بر روی این محیطهای كنترل ، نمایانگر آلوده بودن محیط ها است . بنابراین از این محیطهای آلوده نباید استفاده كرد .

محیط بلاد آگار در داخل یخچال به مدت یك هفته پایدار است و چنانچه بنحوی از تبخیر آب آن جلوگیری شود، پایداری آن بیشتر می‌شود .


روش کار:
ابتدا باتوجه به مندرجات حک شده بروی جعبه اگار وباتوجه به محاسبات مقدار gr0.8 اگار را برمیداریم وداخل ارلن تمیز واستریل میرزیم.سپس به انcc10اب مقطر اضافه میکنیم وروی هینر میگذاریم تااگار خوب حل شودومحلولی شفاف به ما بدهد.( در اینجا دما از 60نباید بالاتر برود).سپس صبر میکنیم محلول تا دمای 45 درجه سانتی گراد سردشود سپس به ان خون را اضافه میکنیم وداخل پلیت میرزیم ومیگذاریم خودش را بگیرد.هنگامی که خود را گرفت در ظرف را گذاشته و انرا برمیگردانیم ودر داخل یخچال نگه داری میگردد